Естественные клетки киллеры nk выполняют функцию. Nk клетки повышены

Лимфоидный росток гемопоэза в костном мозге представлен В-, Т- и NK-клеточными линиями. Клетки-предшественники имеют морфологическую характеристику бластов или зрелых лимфоцитов. В костном мозге В- и Т-лимфобласты составляют очень небольшую долю клеток (менее 0,5 %), лимфоциты - 4,3-13,7 %.

В-лимфоидные предшественники в костном мозге - центральном органе В-лимфопоэза проходят антигеннезависимую стадию созревания. При этом происходит перестройка (реаранжировка) генов иммуноглобулинов, расположенных на хромосомах 2, 22 и 14. Отдельные этапы дифференцировки характеризуются появлением специфичных макромолекул, определяющих иммунофенотип клеток.

На самых ранних про-В-клетках сохраняются антигены стволовых элементов (CD34 и CD38) и появляются специфические макромолекулы пан-BCD19, а затем цитоплазматический CD22. Эти антигены характерны для всех элементов В-лимфоидного ряда. Затем на пре-В-клетках снижается содержание стволово-клеточных и появляются другие В-антигены - CD 10, CD20 и CD24. Следующий этап созревания (npe-В-бласты) характеризуется появлением в цитоплазме клеток (J-цепи Ig. На последнем этапе костномозговой В-дифференцировки на мембране лимфоидных элементов экспрессируется полная молекула (легкие и тяжелые цепи) IgM.

После этого морфологически зрелые, но иммунологически «наивные» В-лимфоциты попадают в кровь и в периферические органы иммунной системы: лимфатические узлы, селезенку и др. Там после контакта с антигеном в зародышевых центрах вторичных лимфоидных фолликулов они проходят антигензависимую стадию дифференцировки. В итоге формируется пул зрелых В-лимфоцитов и плазматических клеток, способных синтезировать и продуцировать иммуноглобулины разных классов, что позволяет им принимать участие в регуляции и осуществлении гуморального ответа иммунной системы.

Предшественники Т-клеток в костном мозге характеризуются экспрессией стволово-клеточных (CD34, HLA-Dr) и Т-антигенов (CD7, цитоплазматический CD3±). Сначала Т-предшественники мигрируют в тимус, который является центральным органом Т-лимфопоэза, а затем поступают в периферические лимфоидные органы, где проходят антигензависимую стадию дифференцировки. В вилочковой железе осуществляется перестройка генов, кодирующих Т-клеточный рецептор (TCR), и TCR появляется на поверхностной мембране. Этот рецептор совместно с белками-продуктами гена главного комплекса гистосовместимости распознает и связывает антигены. Большинство Т-лимфоцитов крови экспрессируют а- и бета-цепи TCR, в то время как Т-лимфоциты эпителия кишечника и слизистой оболочки влагалища - у-и сигма-цепи.

T-лимфоциты: этапы внутритимусной дифференцировки.

Этапы внутритимусной дифференцировки клеток от мигрировавшего в орган костномозгового предшественника (пре-Т-клеток) до зрелого T-лимфоцита, покидающего тимус, связаны с изменением экспрессии фенотипических Т-клеточных маркеров. Основными из них являются: CD4 - корецептор T-хелперов, CD8 - корецептор цитотоксических T-лимфоцитов (T-киллеров) и альфа-бета ТКР (Т-клеточный антигенраспознающий рецептор). Специфическая комбинация этих поверхностных молекул может быть использована в качестве маркеров дифференцировки клеток в тимусе.

Табл.1 Фенотипические маркеры дифференцирующихся тимоцитов

Этап	Маркеры			Тип дифференцирующихся тимоцитов
	Корецепторы Т-клеток	Т-клеточный
			двойной негатив
			двойной позитив
			двойной позитив
			одинарный позитив
			одинарный позитив

На первом этапе из плюрипотентной гемопоэтической стволовой клетки (СКК) костного мозга, обеспечивающей миело- и лимфопоэз, образуется общий для Т- и В-лимфоцитов предшественник.

Ближайшим потомком предшественником Т-лимфоцитов является протимоцит или коммитированный предшественник Т-клеток (пре-Т-кл.). Характерным маркером пре-Т-клеток костного мозга является один из антигенов мозга (АМ). Первые мигрирующие в субкасулярную область тимуса пре-Т-клетки теряют АМ, но приобретают типичный маркер тимоцитов и периферических Т-клеток - Thy-1. Тимоциты субкапсулярной зоны являются в основном двойными негативами и не экспрессируют Т-клеточный рецептор (ТКР). Фенотип таких клеток СD4-CD8-альфа-бета-ТКР-.

Постепенно по мере перемещения в корковый слой тимоциты начинают экспрессию как CD4, так и CD8 корецепторов, а также ТКР. Медуллярная зона тимуса - место локализации бластных форм с фенотипом, характерным для самостоятельных субпопуляций Т-клеток (CD4+CD8-альфа-бета-ТКР+ - Т-хелперы/индукторы; CD4-CD8+альфа-бета-ТКР+).

Отсюда и их название " двойные негативы ". Они заселяют верхнюю часть коры тимуса, расположенную непосредственно под капсулой органа - субкапсулярную область. В полностью развитом тимусе двойные негативные клетки составляют незначительный, всего около 5% от общего числа тимоцитов клеточный пул.

Зрелые Т-лимфоциты присутствуют в периферической крови, в тимусзависимых областях селезенки, лимфатических узлов, миндалин, пейеровых бляшек. В периферической крови Т-лимфоцитарный пул представлен двумя фракциями - хелперами/эффекторами (CD4+) и супрессорами/цитотоксическими клетками (CD8+). Т-лимфоциты CD4+ разделяются на два субтипа: Т-хелперы-1 (Тh1) и Т-хелперы-2 (Th2). Клетки первого типа способны усиливать синтез и продукцию клетками Ig, клетки второго типа - индуцировать антигенспецифическую активность Т-супрессоров.

Т-лимфоидные клетки не синтезируют и не секретируют иммуноглобулины. Они обладают способностью производить белки и гормоны (цитокины), которые регулируют пролиферацию и дифференцировку других клеток, принимают участке в клеточном иммунном ответе.

Естественные (натуральные) киллеры (NK-клетки) имеют независимую линию дифференцировки. В периферической крови они морфологически характеризуются как большие гранулированные лимфоциты с ядром с небольшой выемкой и большими азурофильными гранулами. Их фенотип CD3-, CD16+, CD56+. Они не имеют перестройки TCR, экспрессируют на мембране рецептор к CR2 (CМ). вирусу Эпштейна-Барр, Fc-рецептор - для IgG. NK-клетки способны отвечать за спонтанную клеточную цитотоксичность.

Естественные, или нормальные, киллеры (NK-клетки - аббр. от англ. Natural Killer )

изначально были описаны как большие гра­нулярные лимфоциты, способные распознать в организме некоторые виды раковотранс-формированных клеткок и уничтожить их без предварительной подготовки. Этот факт обус­ловил название клеток. Рецепторный аппарат и механизм действия естественных киллеров (ЕК) долгое время оставались неясными.

Сейчас установлено, что ЕК имеют морфоло­гию малых лимфоцитов, на их долю приходится около 15 % всех лимфоцитов. Они происходят из общей лимфоидной клетки-предшественницы, мигрируют с кровотоком, но отсутствуют в лимфе. Обнаруживаются в печени, селезенке, слизистых, матке. По маркерам, местам типичной локализа­ции и эффекторным механизмам выделяют две субпопуляции ЕК - «кровяную» и «тканевую».

Рецептор к МНС I класса анализирует плот­ность экспрессии этого маркера на мембране клетки. Дефицит этих молекул, наблюдаю­щийся при раковой трансформации клеток, также потенцирует цитотоксичность ЕК.

« Тканевые» ЕК ведут более оседлый образ жизни и обнаруживаются в большом количестве в пече­ни и децидаульной оболочке беременной матки. Несут маркер CD^CDSe"" 0 ™ и много Еэв-лиганда. Реализуемый эффекгорный механизм - антитело-независимая клеточно-опосредованная цитоток-

сичность (см. разд. 11.3.2). Клетками-мишенями являются лимфоциты, активированные пищевы­ми антигенами или аллоантигенами плода.

Помимо цитотоксических функций, ЕК вырабатывают цитокины (ИЛ-5, -8, у-ИФН, ФНО, гранулоцит-моноцит-колониестимули-рующий фактор - ГМ-КСФ и др.), активи­рующие макрофагально-фагоцитарное звено, развитие иммунного ответа и иммунного воспа­ления. Эффекторная функция ЕК усиливается цитокинами (ИЛ-2, -4, -10, -12, у-ИФН и др.).

ΓδТ-лимфоциты

Среди Т-лимфоцитов существует малочис­ленная популяция клеток с фенотипом, пре­имущественно CD4CD8, которые несут на своей поверхности особый TCR уб-типа. Это удТ-лимфоциты. Они практически полностью локализуются в эпидермисе и слизистой же­лудочно-кишечного тракта. Их общая числен­ность невелика - менее 1 % от общего пула Т-лимфоцитов, однако в покровных тканях может достигать 10 %.

Антигенный рецептор убТ-лимфоцита схо­ден с BCR, его активный центр непосредс­твенно связывается с эпитопом антигена. В отличие от а(3-типа, ySTCR не требует для рецепции процессинга антигена, а также его презентации в комплексе с молекулами МНС. Антигенные детерминанты могут быть пред­ставлены, например, молекулами CD1.

Иммунорецептор у8Т-лимфоцита обладает узким «репертуаром» специфичности. Клетки ориентированы на распознавание некоторых широко распространенных микробных ан­тигенов (липопротеинов, белков теплового шока, бактериальных суперантигенов и др.). Клетки принимают участие в удалении патоге­нов на ранних этапах противоинфекционной защиты.

у8Т-лимфоциты могут быть как эффекторны-ми, цитотоксическими клетками, так и регуля­торами иммунореактивности. Они синтезируют цитокины, активирующие местный иммунитет и локальную воспалительную реакцию, в том числе усиливают образование Т2-хелперов. Кроме того, Тб-клетки продуцируют ИЛ-7 и контролируют тем самым численность собственной популяции.

Установлено, что убТ -лимфоциты проис­ходят из автономного ростка в покровных

тканях, образованного стволовыми клетка­ми, мигрировавшими туда на ранних эта­пах эмбриогенеза. В созревании минуют ти­мус. Активируются клетками поврежденного эпителия ЖКТ и эпидермиса. Размножение уб-клеток усиливается под действием ИЛ-7.

Естественные киллеры — это большие гранулярные лимфоциты, низ-кодифференцированные потомки стволовой клетки .

На мембране естественных киллеров содержатся рецепторы к γ -интерферону, ИЛ-2 и ИЛ-12, поэтому указанные цитокины способны активировать естественные киллеры. Также естественные киллеры содержат кластеры CD16 и CD56, по которым проводится лабораторная идентификация этих клеток.

Иммунная толерантность

Различают тканевые и цир-кулирующие естественные киллеры. Тканевые естественные киллеры содержатся в печени и плаценте, обеспечивая поддержание иммунной толерантности к пищевым антигенам и антигенам плода соответственно. Для этого указанные естественные киллеры связываются с активированными лимфоцитами и инициируют каскад апоптоза в них, т е. совершают киллинговый эффект.

Цитотоксичность

Клеточная цитотоксичность

Циркулирующие естественные киллеры обеспечивают защиту от спонтанно измененных собственных клеток (в том числе — опухолевых), а также принимают участие в разрушении вирус-инфицированных клеток.

Реакция, в которой принимает участие естественный киллер, называется спонтанной клеточно-опосредованной цитотоксичностью (СКОЦ), поскольку для ее реализации не требуется антител и комплемента.

Механизм СКОЦ состоит в следующем (рис. 10). С помощью киллинг-активирующего рецептора естественные киллеры взаимодействуют с олигосахарами ганглиозидов и гликозаминогликанов поверхностных структур клеток-мише-ней. Поскольку такие молекулы являются «вездесущими», естественные кил-леры потенциально могут повреждать практически любую собственную клет-ку. Естественно, этого в организме не происходит. Дело в том, что активацию естественного киллера предупреждает киллинг-ингибирующий рецептор, распоз-нающий молекулы HLA I класса (только те разновидности, которые присущи конкретному организму). Поэтому клетки-мишени отбираются по экспрессии специфических молекул HLA I — при отсутствии такой экспрессии или же «чужой» структуре молекул гистосовместимости запускается киллинговый ме-ханизм (так называемый поцелуй смерти). Материал с сайта

Приведенные данные указывают на то, что естественные киллеры активируются при наруше-нии баланса между триггерными рецепторами, реагирующими не только на микробные продукты, но и на структуры активно пролиферирующих собственных клеток, и ингибирующими рецепторами, реагирующими на HLA-мо-лекулы I класса («метки» своего). Такое сочетание неспецифических триггер-ных и специфических ингибирующих рецепторов позволяет естественные киллеры эффективно реагировать на широкий круг мишеней — от чужеродных микробов, ксено-генных и аллогенных клеток до собственных патологически измененных или даже излишне активных клеток.

Первым исследованием всегда является подсчет лейкоцитарной формулы (см. главу «Гематологические исследования»). Оцениваются как относительные, так и абсолютные значения количества клеток периферической крови.

Определение основных популяций (Т-клетки, В-клетки, натуральные киллеры) и субпопуляций Т-лимфоцитов (Т-хелперы, Т-ЦТЛ). Для первичного исследования иммунного статуса и выявления выраженных нарушений иммунной системы ВОЗ рекомендовано определение CD3, CD4, CD8, CD19, CD16+56, соотношение CD4/CD8. Исследование позволяет определить относительное и абсолютное количество основных популяций лимфоцитов: Т-клетки – CD3, В-клетки – CD19, натуральные киллеры (NK) – CD3- CD16++56+, субпопуляции Т лимфоцитов (Т-хелперы CD3+ CD4+, Т-цитотоксические CD3+ CD8+ и их соотношение).

Метод исследования

Иммунофенотипирование лимфоцитов проводится c использованием моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным ангинам на клетках иммунной системы, методом проточной лазерной цитофлуорометрии на проточных цитофлуориметрах.

Выбор зоны анализа лимфоцитов производится по дополнительному маркеру CD45, который представлен на поверхности всех лейкоцитов.

Условия взятия и хранения образцов

Венозная кровь, взятая из локтевой вены, утром, строго натощак, в вакуумную систему до указанной на пробирке метки. В качестве антикоагулянта используется К2ЭДТА. После взятия пробирку с образцом медленно переворачивают 8-10 раз для перемешивония крови с антикоагулянтом. Хранение и транспортировка строго при 18–23°С в вертикальном положении не более 24 ч.

Невыполнение этих условий приводит к некорректным результатам.

Интерпретация результатов

Т-лимфоциты (CD3+ клетки). Повышенное количество свидетельствует о гиперактивности иммунитета, наблюдается при острых и хронических лимфолейкозах. Увеличение относительного показателя встречается при некоторых вырусных и бактериальных инфекциях в начале заболевания, обострениях хронических заболеваний.

Снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов свидетельствует о недостаточности клеточного иммунитета, а именно о недостаточности клеточно-эффекторного звена иммунитета. Выявляется при воспалениях разнообразной этиологии, злокачественных новообразованиях, после травмы, операций, инфаркта, при курении, приеме цитостатиков. Повышение их числа в динамике заболевания – клинически благоприятный признак.

В-лимфоциты (CD19+ клетки) Снижение наблюдается при физиологических и врожденных гипогаммаглобулинемиях и агаммаглобулинемиях, при новообразованиях иммунной системы, лечении иммунодепрессантами, острой вирусной и хронической бактериальной инфекциях, состоянии после удаления селезенки.

NK-лимфоциты с фенотипом CD3-CD16++56+ Натуральные киллеры (NK-клетки) – популяция больших гранулярных лимфоцитов. Они способны лизировать клетки-мишени, инфицированные вирусами и другими внутриклеточными антигенами, опухолевые клетки, а также другие клетки аллогенного и ксеногенного происхождения.

Увеличение количества NK-клеток связано с активацией антитрансплантационного иммунитета, в некоторых случаях отмечается при бронхиальной астме, встречается при вирусных заболеваниях, повышается при злокачественных новообразованиях и лейкозах, в периоде реконвалесценции.

Т-лимфоциты хелперы с фенотипом CD3+CD4+ Увеличение абсолютного и относительного количества наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, может быть при аллергических реакциях, некоторых инфекционных заболеваниях. Это увеличение свидетельствует о стимуляции иммунной системы на антиген и служит подтверждением гиперреактивных синдромов.

Снижение абсолютного и относительного количества Т-клеток свидетельствует о гипореактивном синдроме с нарушением регуляторного звена иммунитета, является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции; встречается при хронических заболеваниях (бронхитах, пневмониях и т.д.), солидных опухолях.

Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD3+ CD8+ Повышение выявляется практически при всех хронических инфекциях, вирусных, бактериальных, протозойных инфекциях. Является характерным для ВИЧ-инфекции. Снижение наблюдается при вирусных гепатитах, герпесе, аутоиммунных заболеваниях.

Соотношение CD4+/CD8+ Исследование соотношения CD4+/CD8+ (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8) рекомендовано только для мониторинга ВИЧ-инфекции и контроля эффективности АРВ терапии. Позволяет определить абсолютное и относительное количество Т-лимфоцитов, субпопуляций Т-хелперов, ЦТЛ и их соотношение.

Диапазон значений – 1,2–2,6. Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах (синдром Ди-Джоржи, Незелофа, Вискотта-Олдрича), при вирусных и бактериальных инфекциях, хронических процессах, воздействии радиации и токсических химических веществ, множественной миеломе, стрессе, снижается с возрастом, при эндокринных заболеваниях, солидных опухолях. Является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции (менее 0,7).

Увеличение значения более 3 – при аутоиммунных заболеваниях, остром Т-лимфобластном лейкозе, тимоме, хроническом Т-лейкозе.

Изменение соотношения может быть связано с количеством хелперов и ЦТЛ у данного пациента. Например, снижение количества CD4+ Т-клеток при острой пневмонии в начале заболевания ведет к снижению индекса, а ЦТЛ при этом могут не измениться.

Для дополнительного исследования и выявления изменений иммунной системы при патологиях требующих оценки наличия острого или хронического воспалительного процесса и степени его активности, рекомендуется включать подсчет количества активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+HLA-DR+ и ТNK–клеток с фенотипом CD3+CD16++56+.

Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+HLA-DR+ Маркер поздней активации, показатель гиперреактивности иммунитета. По экспрессии данного маркера можно судить о выраженности и силе иммунного ответа. Появляется на Т-лимфоцитах после 3-го дня острого заболевания. При благоприятном течении заболевания снижается до нормы. Увеличение экспрессии на Т-лимфоцитах может быть при многих заболеваниях, связанных с хроническим воспалением. Отмечено его повышение у пациентов с гепатитом С, пневмониями, ВИЧ-инфекцией, солидными опухолями, аутоиммунными заболеваниями.

ТNK-лимфоциты с фенотипом CD3+CD16++CD56+ Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности маркеры CD16++ CD 56+. Эти клетки имеют свойства как Т-, так и NK-клеток. Исследование рекомендовано как дополнительный маркер при острых и хронических заболеваниях.

Снижение их в периферической крови может наблюдаться при различных органоспецифических заболеваниях и системных аутоиммунных процессах. Увеличение отмечено при воспалительных заболеваниях разной этиологии, опухолевых процессах.

Исследование ранних и поздних маркеров активации Т-лимфоцитов (CD3+CD25+, CD3-CD56+, CD95, CD8+CD38+) дополнительно назначают для оценки изменений ИС при острых и хронических заболеваниях, для диагностики, прогноза, мониторинга течения заболевания и проводимой терапии.

Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+CD25+, рецeптор к ИЛ2 CD25+ – маркер ранней активации. О функциональном состоянии Т-лимфоцитов (CD3+) свидетельствует количество экспрессирующих рецепторов к ИЛ2 (CD25+). При гиперактивных синдромах количество этих клеток возрастает (острые и хронические лимфолейкозы, тимома, отторжение трансплантата), кроме того, повышение их может свидетельствовать о ранней стадии воспалительного процесса. В периферической крови их можно выявить в первые три дня болезни. Снижение числа этих клеток может наблюдаться при врожденных иммунодефицитах, аутоиммунных процессах, ВИЧ-инфекции, грибковых и бактериальных инфекциях, ионизирующей радиации, старении, отравлении тяжелыми металлами.

Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD8+CD38+ Присутствие CD38+ на ЦТЛ лимфоцитах отмечено у пациентов с разными заболеваниями. Информативный показатель при ВИЧ-инфекции, ожоговой болезни. Увеличение числа ЦТЛ с фенотипом CD8+CD38+ наблюдается при хронических воспалительных процессах, онкологических и некоторых эндокринных заболеваниях. При проведении терапии показатель снижается.

Субпопуляция натуральных киллеров с фенотипом CD3- CD56+ Молекула CD56 – адгезивная молекула, широко представленная в нервной ткани. Кроме натуральных киллеров, экспрессируется на многих типах клеток, в том число на Т-лимфоцитах.

Увеличение данного показателя свидетельствуют о расширении активности специфического клона клеток киллеров, которые имеют меньшую цитолитическую активность, чем NK-клетки с фенотипом CD3- CD16+. Количество этой популяции возрастает при гематологических опухолях (ЕК-клеточная или Т-клеточная лимфома, плазмоклеточная миелома, апластическая крупноклеточная лимфома), хронических заболеваниях, некоторых вырусных инфекциях.

Снижение отмечается при первичных иммунодефицитах, вирусных инфекциях, системных хронических заболеваниях, стрессе, лечении цитостатиками и кортикостероидами.

Рецептор CD95+ – один из рецепторов апоптоза. Апоптоз – сложный биологический процесс, необходимый для удаления из организма поврежденных, старых и инфицированных клеток. Рецептор CD95 экспрессируется на всех клетках иммунной системы. Он играет важную роль в контроле функционирования иммунной системы, так как является одним из рецепторов апоптоза. Его экспрессия на клетках определяет готовность клеток к апоптозу.

Снижение доли CD95+-лимфоцитов в крови пациентов свидетельствует о нарушении эффективности последнего этапа выбраковки дефектных и инфицированных собственных клеток, что может привести к рецидиву заболевания, хронизации патологического процесса, развитию аутоиммунных заболеваний и повышению вероятности опухолевой трансформации (к примеру, рака шейки матки при папилломотозной инфекции). Определение экспрессии CD95 имеет прогностическое значение при миело- и лимфопролифератиных заболеваниях.

Повышение интенсивности апоптоза наблюдается при вирусных заболеваниях, септических состояниях, при употреблении наркотических средств.

Активированные лимфоциты CD3+CDHLA-DR+, CD8+CD38+, CD3+CD25+, CD95. Тест отражает функциональное состояние Т-лимфоцитов и рекомендован для контроля за течением заболевания и контроля иммунотерапии при воспалительных заболеваниях разной этиологии.

1298 0

В первой половине 1970-х годов Т. Timonen и R. Herberman описали ранее неизвестную субпопуляцию лимфоцитов, которые были определены как естественные киллерные клетки или естественные киллеры (ЕК) (NK - natural killers).

Впервые клетки этой субпопуляции выявили у человека и мышей, а затем - практически у всех млекопитающих (крысы, хомячки, кошки, обезьяны, собаки), а также рыб и птиц.

В течение трех десятилетий эти клетки являются объектом активного изучения.

В частности, у рыб родов Tilaria, Catfish, Teleost эти клетки играют важную роль во врожденном иммунитете и в отличие от естественных киллеров млекопитающих секретируют растворимую, но не экспрессируют мембранно-связанную, цитокиноподобную форму FasL и экспрессируют молекулу, которая функционирует как антигенраспознаюший рецептор. Поскольку эти клетки в настоящее время рассматриваются как эквивалент ЕК, активированных IL-2 (ЛАК), то они могут служить очень удачной филогенетической моделью для изучения механизмов распознавания ЕК.

Успехи в изучении естественных киллеров млекопитающих были обеспечены усилиями различных авторов, среди которых в первую очередь следует отметить: R. Herberman, М. Robertson, Т. Whiteside, R. Zinkernagel, D. Kagi, L. Lanier, J. Phillips, A. Cerwenka, A. Moretta, L. Moretta, N. Vujanovic и многих других.

Интерес к изучению ЕК обусловлен рядом причин и прежде всего тем, что система ЕК является одной из наиболее древних в эволюционном плане. Это определяет их центральную роль во врожденном иммунитете и их большое значение при различных физиологических и патологических процессах.

Расширение исследований молекулярных механизмов распознавания привело к получению новой информации, согласно которой естественные киллеры способны распознавать классические молекулы антигенов I класса главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) , неклассические молекулы антигенов I класса ГКГ и молекулы, ассоциированные с антигенами I класса главного комплекса гистосовместимости.

Цитотоксическое действие ЕК особенно важно в организме с развиваюшейся опухолью, потому что, осуществляя функции противоопухолевого надзора, они обладают способностью взаимодействовать с опухолевыми клетками на различных этапах их дифференцировки. Наконец, чрезвычайно важным является то обстоятельство, что ЕК осуществляют контроль за метастазированием.

С точки зрения оценки роли естественных киллеров в процессе метастазирования представляют интерес данные о том, что удаление ЕК приводит к еще более резкому увеличению метастазов, чем у перфориндефицитных мышей. Из этих данных следует, что в контроле за метастазированием ЕК используют как перфоринзависимый, так и перфориннезависимый пути.

Естественные киллеры имеют костно-мозговое происхождение, однако не проявляют цитотоксического действия в костном мозгу, их созревание не связано с тимусом, они присутствуют во всех органах и периферической крови. По своей структуре ЕК относятся к большим гранулярным лимфоцитам и их морфологические и ультраструктурные свойства изучены достаточно подробно.

Основными маркерами ЕК являются CD16 (FCyRIII), который экспрессируют лишь 14-16 % клеток и CD56; 70 % естественных киллеров экспрессируют CD7, который функционирует как ко-стимулирующая молекула, является индуктором адгезии и от 30 до 60 % CD11с; ЕК не экспрессируют CD3, не имеют TCR.

Одной из отличительных особенностей ЕК по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ) служит их способность осуществлять спонтанную цитотоксичность, которая не требует предварительной сенсибилизации и не рестриктирована антигенами ГКГ. Подобно другим клеткам системы иммунитета, естественные киллеры - гетерогенная субпопуляция и отдельные клоны этих клеток могут быть идентифицированы по ряду признаков, в первую очередь - фенотипически и функционально.

Наряду с центральной функцией - цитотоксичностью, ЕК выполняют и другие функции: участвуют в регуляции взаимодействия различных клеток системы иммунитета в норме и при патологии. Активность ЕК регулируется множеством цитокинов, которые продуцируются какгемопоэтическими, так и негемопоэтическими клетками, а также экзогенными факторами разнообразной природы.

Основными регуляторами активности естественных киллеры, как известно, являются IFNy, IL-2, IL-4, IL-15, IL-21. Наличие большого количества информации, касающейся естественных киллеров, их свойств и особенностей избавляет от необходимости подробного изложения этих данных. Поэтому ниже представлены данные о роли ЕК в опухолевом процессе с акцентом на наиболее важных аспектах. При этом важно обратить внимание на следующее.

Достаточно распространена точка зрения, согласно которой роль ЕК важна преимущественно на первых этапах опухолевого процесса, и по мере роста опухоли их роль в деструкции опухолевых клеток уменьшается, уступая место другим клеткам, в частности ЦТЛ.

Тем не менее еще в начале 1980-х годов R. Herberman и соавт. показали, что естественные киллеры осуществляют контроль за диссиминацией и метастазированием опухолевых клеток. Вначале этот важный вывод был аргументирован результатами опытов с меланомой и опухолевыми клетками линии 3LL. Было показано, что введение сыворотки крови, содержащей антиазиало-СМ-антитела, которые избирательно ингибируют ЕК, приводит к быстрому метастазированию в легкие.

Последующие исследования на модели аденокарциномы грудной железы (MADB106) подтвердили предыдущий вывод - перенос очищенной фракции больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) мышам, у которых функция ЕК была подавлена указанным выше образом, приводил к удалению потенциально метастазирующих опухолевых клеток из циркуляции.

Дальнейшим сравнительным изучением роли цитотоксических лимфоцитов и естественных киллеров в контроле за опухолевым ростом с учетом особенностей клинического течения установлено, что главенствующее место в этом контроле принадлежит ЕК. Такие данные получены при исследовании меланомы увеальной радужной оболочки глаза, которая характеризуется злокачественным течением и быстрым метастазированием.

Различные клоны естественных киллеров

Как отмечалось, ЕК, подобно другим клеткам, представляют собой гетерогенную популяцию. Констатация этой гетерогенности основывается на различных критериях, включая и локализацию естественных киллеров.

Попытки выделить различные клоны ЕК начали предприниматься вскоре после идентификации этой субпопуляции клеток. Первые из них относились к выявлению различных поверхностных антигенов, экспрессируемых лимфоцитами. Уже на начальных этапах таких исследований было отмечено, что ЕК представлены клетками, различающимися фенотипически и функционально.

Показано также, что БГЛ, к которым относятся естественные киллеры, не прилипают ни к пластику, ни к нейлону, однако среди них было выделено две фракции в градиенте фиколла, отличающихся по плотности экспрессии Е-рецептора; фракция с высокой плотностью Е-рецептора обладала большим аффинитетом к образованию розеток.

После того как было установлено, что ЕК лизируют клетки-мишени, удалось выделить клоны ЕК, одни из которых осуществляют антителозависимую цитотоксичность, а другие - лектинзависимую и не идентичны по способности к лизису различных мишеней. Высказано предположение, что такая гетерогенность может быть обусловлена наличием вариантов в зависимости от уровня дифференцировки естественных киллеров и/или их активности.

Несмотря на известный факт, согласно которому неактивированные ЕК не прилипают к пластику, в последующем было показано, что после активации IL-2 выделяются две фракции: клетки, прилипающие и не прилипающие к пластику; прилипающие ЕК (CD3-CD56+) характеризовались выраженной способностью к лизису клеток-мишеней.

Дальнейшими исследованиями установлено, что процент прилипающих естественных киллеров зависел от времени инкубации с IL-2 и их цитотоксичность блокировалась антителами против IL-2RP, ICAM-1, CD2 и LFA-3, но не антителами к lL-2Ra или СD56-антигену; фракция прилипающих естественных киллеров была обогащена клетками CD56(dim) и CD16(dim), которые экспрессировали IL-2Ra и IL-2Rв.

Отмечено также, что прилипающие ЕК активно пролиферировали, имели низкую плотность антигена CD56, проявляли высокий уровень цитотоксичности против К562-мишеней (по сравнению с фракцией, содержащей неприлипающие клетки), однако цитотоксичность против клеток линии Daudi была сходной. Фенотипически естественные киллеры могут отличаться и по плотности поверхностного маркера CD56 - CD56(bright) и CD56(dim).

Значительное число исследователей при идентификации различных клонов ЕК, наряду с фенотипическими свойствами, учитывали и функциональную активность рецепторов естественных киллеров (ЕКР) .

В настоящее время стало известно, что ЕК различаются и по их роли в иммунологическом ответе.

В частности, CD56(dim) естественных киллеров субпопуляция проявляет большую цитотоксичность, экспрессирует высокий уровень иммуноглобулиноподобных ЕК-рецепторов и FcyRIII (CD16) по сравнению с клетками CD56(bright). В отличие от этого последние обладают выраженной способностью продуцировать цитокины после активации моноцитами, но имеют низкую цитотоксичность и экспрессируют либо CD16(dim), либо вообще не имеют этого маркера; существует гетерогенность и по другим функциональным свойствам упомянутых субпопуляций.

В результате распределения ЕК по плотности экспрессии CD56-CD56(bright) и CD56(dim), стало возможным получить данные и о других различиях этих клеток. В частности, выяснилось, что CD56(bright) экспрессируют несколько изоформ ингибиторных иммуноглобулиноподобных рецепторов - CD158a, CD158b, NKB1, в то время каклекти-ноподобный рецептор - CD94/NKG2, выявлен на клетках обоих субпопуляций.

Установлено также, что ЕК этих субпопуляций имеют различия и по способности продуцировать цитокины, а также оказывать цитотоксическое действие: CD56(bright) продуцируют IFNy и TNFa, но проявляют слабую цитотоксичность, что может быть связано со снижением способности формировать конъюгаты с клетками-мишенями и низким содержанием перфорин-гранзимов в их гранулах. Авторы этих интересных исследований рассматривали CD56(bright) как специализированные естественные киллеры, которые регулируют иммунологический ответ, в первую очередь путем продукции цитокинов.

При исследовании ЕК с различной плотностью экспрессии CD56 учитывались и другие характеристики. Так, было показано, что клетки с высокой плотностью экспрессии антигена CD56 (CD56+hi ЕК) экспрессируют более высокий уровень CD25, CD 122, CD45R0 и более низкий уровень CD45RA по сравнению с клетками с низкой плотностью CD56 (CD56+lo ЕК); CD56+hi экспрессируют высокий уровень ко-стимулирующих молекул CD2, CD7, что предполагает их более выраженную способность к ответу на различные стимулы; клетки этого же клона экспрессируют и различные адгезивные молекулы.

Представляет существенный интерес то, что указанные клоны различаются по характеру экспрессии CD16, что может быть причиной необходимости различных условий для активации клеток каждого из этих клонов. Например, CD56+hi не экспрессируют или имеют низкий уровень CD16, что объясняет их низкую способность к антителозависимой цитотоксичности, однако наряду с этим они характеризуются высокой активностью лектинподобных рецепторов.

Описаны два клона и по плотности активационных рецепторов - EKP(bright) и EKP(bull); установлено, что различные естественные киллеры имеют разные соотношения этих клонов и очень варьируют по своей цитотоксичности. При некоторой патологии, например при миелоидной лейкемии, большинство ЕК экспрессируют фенотип "bull".

На основании этих новых данных, авторы пришли к заключению, что плотность триггерных рецепторов определяет цитотоксичность, но эти рецепторы различаются по чувствительности к некоторым цитокинам, в частности TGF-1, который снижает экспрессию NKp30 и частично NKG2D, но не влияет на NKp46. Из этого следует, что опухолевые клетки, продуцирующие TGF-1, могут приобретать резистентность к ЕК-лизису.

Выделяются клоны и по способности к продукции IFNy - ЕК1 и ЕК2, (возможна аналогия с Тh1 и Th2). Естественные киллеры, продуцирующие IFNy, не секретируют IL-4, IL-5 и IL-13, в отличие от ЕК, которые не продуцируют IFNy, а продуцируют IL-4, IL-5, IL-13; эти данные показывают, что циркулирующие ЕК человека имеют различный цитокиновый профиль, а соответственно могут играть и различную роль в воспалении.

Способностью лизировать различные мишени в зависимости от экспрессии высоко- и низкоаффинных рецепторов IL-2 объясняют наличие гетерогенности естественных киллеров и другие исследователи. Так, в общей популяции ЕК одни клетки экспрессируют а-цепь IL-2R, а другие - в-цепь, соответственно и лизируют различные клетки-мишени; указанные различия в способности к лизису авторы объясняют установленной ими гетерогенностью в гене, контролирующем лизис мишеней.

По способности ответа на хемокины идентифицированы два клона ЕК человека - CD56(dim)CD16+ и CD56(bright)CD16- Покоящиеся CD56(dim)CD16+ экспрессируют CXCR1, CXCR2, CXCR3 и CX3CR, не экспрессируют рецепторы для хемокинов семейства СС, мигрируют в ответ на CXCL12 и CXC3L1.

В отличие от этого покоящиеся CD56(bright)CD16- экспрессируют небольшое количество CXCR1, CXCR2, CXC3R1, но высокий уровень CCR5 и CCR7; указанные клоны естественных киллеров разделяются по характеру своего ответа на отдельные цитокины, что проявляется различием в уровне их цитотоксичности и пролиферации.

Следует обратить внимание, что in vivo в активном лизисе опухолевых клеток участвуют ЕК, которые продуцируют CCL19 или CCL21 - хемокины, играющие важную роль в афферентном и эфферентном ответе ЕК на опухолевые клетки и инфекцию.

В общей популяции естественных киллеров существуют и клоны, различающиеся по способности экспрессировать ингибиторные и триггерные рецепторы; соответствующие данные по этому вопросу представлены в разделе о рецепторах ЕК.

Как следует из упомянутых данных, ЕК гетерогенны по своему составу и различаются по ряду параметров. Несмотря на то что выявление отдельных клонов происходило по различным критериям, в подавляющем большинстве случаев окончательным критерием оценки гетерогенности была их способность к лизису.

Бережная Н.М., Чехун В.Ф.